Las imágenes de voltaje revelan las firmas eléctricas dinámicas de las células de cáncer de mama humano

May 16, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 5, número de artículo: 1178 (2022) Citar este artículo

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Las células cancerosas presentan un potencial de membrana en reposo (Vm) que está despolarizado en comparación con las células normales y expresan conductancias iónicas activas, que influyen directamente en su comportamiento fisiopatológico. A pesar de las similitudes con los tejidos "excitables", se sabe relativamente poco sobre la dinámica del Vm de las células cancerosas. Aquí, las imágenes de Vm de alto rendimiento y resolución celular revelan que Vm fluctúa dinámicamente en varias líneas celulares de cáncer de mama en comparación con las células MCF-10A no cancerosas. Caracterizamos las fluctuaciones de Vm de cientos de células MDA-MB-231 de cáncer de mama humano triple negativo. Al cuantificar sus Firmas Eléctricas Dinámicas (DES) a través de un protocolo de aprendizaje automático no supervisado, identificamos cuatro clases que van desde "ruidosas" hasta "parpadeantes/ondeantes". La Vm de las células MDA-MB-231 exhibe hiperpolarizaciones transitorias espontáneas inhibidas por la tetrodotoxina, bloqueadora de los canales de sodio dependiente de voltaje, y por inhibidores de los canales de potasio activados por calcio, apamina e iberiotoxina. La Vm de las células MCF-10A es comparativamente estática, pero las fluctuaciones aumentan después del tratamiento con el factor de crecimiento transformante β1, un inductor canónico de la actividad epitelial. transición a mesenquimal Estos datos sugieren que la capacidad de generar fluctuaciones de Vm puede ser una propiedad de las células epiteliales-mesenquimales híbridas o de aquellas originadas a partir de progenitores luminales.

Todas las células del cuerpo exhiben una diferencia de voltaje (Vm) a través de la membrana plasmática que regula una amplia gama de funciones como la expresión genética, la secreción y la motilidad de las células completas. La Vm celular en reposo varía tanto entre tipos de células como dentro de ellos. Curiosamente, si bien esto es ca. −70 mV en células maduras 'quiescentes', incluidos nervios y músculos, está notablemente despolarizado (Vm aprox. −50 a −10 mV) en células en proliferación, incluidas células cancerosas y células madre1,2.

Vm fluctúa dramáticamente, tanto de manera espontánea como en respuesta a estímulos, en tejidos clásicamente excitables como el corazón, los músculos y los nervios, que apoyan la generación y conducción de potenciales de acción. Se ha demostrado que la Vm en reposo de varios tipos de células fluctúa3. Estas incluyen células con actividad rítmica, por ejemplo, neuronas que controlan la respiración4, la vasomoción arterial5, los "relojes" biológicos6 y el sueño7,8. Las oscilaciones de Vm también se manifiestan en situaciones fisiopatológicas, como la epilepsia y la degeneración neuronal, y pueden extenderse a efectos de red9,10.

En varios carcinomas, la expresión funcional de los canales de sodio dependientes de voltaje (VGSC) promueve el proceso metastásico11. El tratamiento de células de carcinoma in vitro con bloqueadores de VGSC suprime parcialmente la invasión 3D12,13. El inhibidor más específico de las VGSC es la tetrodotoxina (TTX), que bloquea el canal uniéndose a un sitio dentro del poro del canal cuando el canal está en estado abierto14. TTX reduce la invasión de células de carcinoma in vitro, y este efecto se elimina mediante el silenciamiento del ARNip del VGSC Nav1.5 in vivo12,13,15,16. Gradek et al. Recientemente se demostró que el silenciamiento de SIK1 induce la expresión, invasión y expresión de Nav1.5 del factor de transcripción SNAl117 asociado a la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT). Sin embargo, como se señaló anteriormente, la Vm en reposo en estado estacionario de las células de cáncer de mama humano en relación con el epitelio normal está fuertemente despolarizada18. En el caso de las células MDA-MB-231, derivadas de un cáncer de mama triple negativo (TNBC) altamente agresivo, la Vm se sitúa entre −40 y −20 mV15,19,20. La inactivación de VGSC dependiente de Vm significa que la mayoría de los canales deberían estar permanentemente inactivados en tales potenciales de membrana despolarizados y, por lo tanto, insensibles a TTX. Sin embargo, se ha demostrado repetidamente que la TTX inhibe la invasividad de estas células y de varios otros carcinomas11,15,19,21,22,23,24, bloqueando potencialmente la corriente de ventana persistente19,25.

Aunque la despolarización de la Vm en reposo y la expresión enriquecida de VGSC en líneas celulares cancerosas agresivas están establecidas (revisado por Yang y Brackenbury2 y Pardo y Stühmer26), a diferencia de los tejidos excitables clásicos (p. ej., corazón, músculo, nervio), se sabe comparativamente poco sobre la actividad del cáncer. Dinámica de VM. Los estudios que utilizaron matrices de electrodos múltiples detectaron fluctuaciones de Vm pero no pudieron atribuirlas a células individuales27,28. Aquí, por el contrario, capturamos la dinámica de Vm resuelta espacialmente y con resolución celular en células de cáncer de mama humano con un tinte rápido, electrocrómico sensible al voltaje, lo que permite el monitoreo óptico de los cambios de Vm en cientos de células simultáneamente. A través de un protocolo de aprendizaje automático no supervisado, clasificamos y caracterizamos las firmas eléctricas dinámicas (DES) de la serie temporal de Vm celular obtenidas con imágenes de alto rendimiento. Un subconjunto de células de cáncer de mama MDA-MB-231 exhibió "parpadeos" y "ondas" hiperpolarizantes, en contraste con la Vm estática y en reposo de las células MCF-10A no tumorigénicas. La aplicación de TTX suprimió las fluctuaciones de Vm en las células MDA-MB-231, mientras que el tratamiento de las células MCF-10A con el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β), que estimula la EMT, indujo fluctuaciones de Vm en estas células. En conjunto, estos datos sugieren que la capacidad de generar fluctuaciones de Vm se adquiere durante la EMT y puede participar en la progresión del cáncer.

Tomamos imágenes del potencial de membrana de monocapas de células cultivadas con di-4-AN(F)EP(F)PTEA aplicado extracelularmente, un tinte que se inserta en la membrana externa, cambiando sus espectros de absorción y emisión en función del potencial de membrana con sub- fidelidad temporal de microsegundos29. Excitamos secuencialmente el tinte con diodos emisores de luz azul y verde (LED, Figs. 1a, b y S1), tomando la relación de fluorescencia excitada por cada color en cada momento y dividiéndola por la relación de referencia (ΔR/R0). . Un cambio en Vm hace que la fluorescencia excitada por cada color cambie en direcciones opuestas (Fig. 1c), amplificando el cambio correspondiente en la relación. El esquema de imágenes ratiométricas también mitiga parcialmente los errores del etiquetado desigual del tinte, la descomposición del fotoblanqueo y el movimiento mecánico30. Este enfoque nos permitió obtener imágenes de la dinámica de cientos de células de cáncer de mama humano simultáneamente con resolución celular.

a Esquema del sistema de imágenes de epifluorescencia de campo amplio con excitación de dos colores. b Célula MDA-MB-231 teñida con di-4-AN(F)EP(F)PTEA con pinza de voltaje simultánea c Las líneas azul y roja muestran los espectros de excitación y emisión de di-4-AN(F)EP(F)PTEA29 , respectivamente. La fluorescencia se excita mediante LED azules y verdes en lados opuestos del máximo de excitación (líneas discontinuas verticales negras). La disminución o el aumento de Vm hace que los espectros de excitación se desplacen hacia la derecha o hacia la izquierda, respectivamente. Por lo tanto, la disminución de Vm provoca una emisión reducida en respuesta a la excitación del canal azul y un aumento de la fluorescencia con la excitación del canal verde y viceversa para el aumento de Vm. d Formas de onda que controlan la pinza de voltaje de celda completa MDA-MB-231 para calibrar la relación de fluorescencia excitada de azul a verde con respecto a la línea de base (ΔR/R0). e Señal ΔR/R0 registrada en respuesta a las formas de onda Vm inyectadas. f Cambio promedio de ΔR/R0 con cambio de voltaje de membrana y un ajuste lineal a los datos que indican la sensibilidad de la imagen (% de cambio en la relación por cambio de voltaje de membrana de 100 mV). g Sensibilidades medidas para diferentes células parcheadas con una estimación del núcleo gaussiano (sobre azul). h Ejemplo de evolución temporal de una célula MDA-MB-231 espontáneamente activa que muestra hiperpolarizaciones Vm transitorias típicamente observadas (indicadas por marcas rojas). Gris, curso de tiempo sin filtrar, negro, curso de tiempo filtrado gaussiano, sigma = 3 puntos de muestreo (0,6 s).

Primero verificamos que la relación de fluorescencia (ΔR/R0) informaba linealmente cambios en Vm. Al obtener imágenes de la fluorescencia de Di-4-AN(F)EP(F)PTEA, mientras avanzamos Vm a través de un rango de valores en la abrazadera de voltaje de celda completa de las células MDA-MB-231, observamos que la proporción de azul a verde La fluorescencia de Di-4-AN (F) EP (F) PTEA varió linealmente con cambios en Vm en un rango fisiológico de Vm de −60 a +30 mV. La pendiente de ΔR / R0 frente a Vm mostró una sensibilidad promedio de 5,1 ± 0,43% por 100 mV (media ± error estándar de la media (sem); n = 12 células; Fig. 1d-g). Además, como se esperaba, la despolarización global de todas las células en el cubreobjetos mediante el lavado en una solución extracelular con alto contenido de potasio (100 mM) también aumentó ΔR/R0 (Fig. S2). Estos resultados muestran que la relación ΔR / R0 informa fielmente los cambios de Vm en registros posteriores de fluctuaciones espontáneas de Vm (Fig. 1h).

Comparamos la frecuencia de eventos negativos, transitorios y detectados ópticamente ("-VE") en células MCF-10A no tumorigénicas con la de ocho líneas celulares de cáncer de mama humano: MDA-MB-231, MDA-MB-468, Cal-51, SUM-159, Hs578T, MDA-MB-453 y BT-474, y T-47D. La Figura 2 muestra la tasa de −VE para cada campo de visión fotografiado. Todas las líneas celulares de cáncer exhiben una tasa −VE significativamente mayor que la de la línea epitelial mamaria benigna MCF-10A: MDA-MB-231 (p = 1,4 × 10−8), MDA-MB-468 (p = 1,1 × 10−8), Cal-51 (p = 1,1 × 10−5), SUM-159 (p = 3,4 × 10−3), Hs578T (p = 5,7 × 10−6), MDA-MB-453 (p = 5,2 × 10−5), BT-474 (p = 2,2 × 10−11) y T-47D (p = 0,01). Los valores de p son para la comparación de la tasa promedio de eventos negativos "-VE" por campo de visión para cada línea celular cancerosa en comparación con la línea MCF-10A no tumorigénica utilizando una prueba U de Mann-Whitney con Benjamini-Hochberg. corrección para comparaciones múltiples (tasa de descubrimiento falso = 0,05). Sorprendentemente, el alcance de la actividad se correlacionó fuertemente con el subtipo de línea. Las líneas cancerosas previamente clasificadas como Luminal B (BT-474, MDA-MB-453) o Basal A (MDA-MB-468) fueron las más activas31 (Fig. 2). Pero si bien las líneas Luminal A y Basal B eran menos activas que Luminal B o Basal A, eran notablemente más activas que las células no transformadas.

Cada círculo indica la tasa media de eventos negativos "-VE" (por celda, por 1000 s) para todas las células en el campo de visión de una prueba de imágenes. Todas las líneas celulares de cáncer exhiben una tasa −VE significativamente mayor que la de la línea epitelial mamaria benigna MCF-10A (valores de p todos ≤0,01. Los valores de p son para la comparación del promedio por campo de visión − Tasa de VE para cada línea celular cancerosa en comparación con la línea MCF-10A no cancerosa utilizando una prueba U de Mann-Whitney con corrección de Benjamini-Hochberg para comparaciones múltiples (tasa de descubrimiento falso = 0,05).

Las siguientes secciones caracterizan ópticamente la dinámica Vm del MDA-MB-231, un modelo ampliamente estudiado de cáncer de mama metastásico triple negativo.

Un subconjunto de células MDA-MB-231 exhibió Vm fluctuante. Tomamos imágenes de fluctuaciones espontáneas de Vm a 5 cuadros / s en monocapas cultivadas de la línea celular de cáncer de mama triple negativo altamente agresiva MDA-MB-231 (Fig. 3a). 6,84 ± 0,97% (n = 22 cubreobjetos) de las células en cada cubreobjetos mostraron una Vm fluctuante (Fig. 3b, c). La gran mayoría (>90%, 91/100) de los eventos de alta relación señal-ruido y gran amplitud (>∣1.5%∣ΔR/R0) fueron negativos ("-VE", Fig. 3b). Por lo tanto, los análisis posteriores se centran en los −VE (Fig. 2a, b). La mayoría de las células mostraron pocas o ninguna fluctuación, pero un subconjunto de células fue muy activo (Fig. 3c, ver también Película complementaria 1). Entre las células activas, se detectaron eventos con una frecuencia promedio de 2 ± 0,2 eventos/célula/1000 s (n = 20 cubreobjetos, Fig. 3d).

a Se tomaron imágenes de la relación de fluorescencia de Di-4-AN (F) EP (F) PTEA (ΔR/R0) a 5 fotogramas/s en células MDA-MB-231 cultivadas. La serie temporal ΔR/R0 extraída de las células segmentadas (derecha) revela fluctuaciones heterogéneas de Vm que consisten principalmente en hiperpolarizaciones transitorias. b Un histograma 2D a escala logarítmica de la amplitud y duración del evento. Estas fluctuaciones varían en su polaridad (positiva, "+VE'' versus negativa "-VE''), amplitud y duración. Las grandes fluctuaciones de amplitud eran típicamente hiperpolarizantes (amplitud −VE) y de corta duración. c Proporción de células activas para 20 réplicas técnicas que muestran la alta variabilidad en la proporción de células activas. d Un histograma a escala logarítmica de la tasa media de VE para todas las células activas (al menos una VE observada) que muestra la distribución de cola larga con unas pocas células muy activas.

Luego buscamos describir la "firma eléctrica dinámica" (DES) de células individuales en función de sus series temporales de imágenes de Vm. Un DES es un vector de características multiparamétrico que captura varios aspectos de las fluctuaciones de Vm a lo largo del tiempo, como las propiedades espectrales de potencia, diferencias y entropía. Un DES captura variaciones más allá de las métricas basadas en eventos y puede usarse para clasificar patrones en función de su similitud. Para describir los DES, implementamos una canalización de aprendizaje automático no supervisado (Fig. 4). La canalización DES celular utiliza el algoritmo Catch-2232 para extraer características de trazas de Vm individuales. La extracción de características y la agrupación jerárquica en las series de tiempo celulares "activas", aquellas en las que se detectaron fluctuaciones de Vm (287 de 2993, Fig. 4a-c), produjeron coeficientes de silueta lo que indica que las series de tiempo se agruparon en 3 o 4 clases (Fig. 4d). La inspección manual de la serie temporal reveló un grupo interno más alto de manera similar con 4 grupos. Nombramos las clases DES identificadas por la clasificación de 4 grupos: parpadeo pequeño (parpadeo-S), ondulación, ruidoso y parpadeo grande (parpadeo-L). La Figura 5 muestra series temporales ejemplares de cada clase. Se observaron células de las cuatro clases simultáneamente en los campos de visión (FOV) de las imágenes. Juntas, estas cuatro clases de DES describen la heterogeneidad temporal de las fluctuaciones de Vm en células MDA-MB-231.

a Las series temporales fueron admitidas en el proceso de agrupamiento de aprendizaje automático no supervisado si su ΔR/R0 filtrado temporalmente mostraba fluctuaciones > 2,5 veces su desviación estándar de píxeles dentro del ROI con respecto al valor medio de píxeles, y si también estaban libres de artefactos de imagen, incluidos polvo flotante, mecánica efectos de vibración y borde de iluminación. b La inspección visual de la serie temporal de cada celda finalizó la admisión a la tubería DES celular. c Se extrajeron 22 características relevantes para los patrones temporales de series temporales de cada serie temporal utilizando el algoritmo Catch-2232 y se normalizaron con una transformación Box-Cox relativa a sus valores. d Los coeficientes de silueta para diferentes números de conglomerados se generaron mediante agrupamiento jerárquico (azul) o modelado de mezcla gaussiana (GMM, naranja) en las características normalizadas.

Se seleccionaron series de tiempo representativas ordenando los valores de las características que apuntan en la dirección de cada tipo en el espacio de PC 2D.

Para evaluar el papel de la actividad de VGSC en el DES de las células MDA-MB-231, tratamos cultivos con tetrodotoxina (TTX), un inhibidor potente y específico de las VGSC14. La capacidad de los tintes electrocrómicos para informar los efectos del TTX está bien establecida33. TTX disminuyó la frecuencia de las fluctuaciones de Vm, especialmente de las hiperpolarizaciones de gran amplitud (-VE, Fig. 6a, b), de una manera dependiente de la dosis. En particular, 10 μM de TTX disminuyó la tasa media de eventos en ~4 ×, de 9,5 × 10 −5 a 1,97 × 10 −5 eventos/célula/s (p < 10 −6, prueba de significancia con arranque unilateral sobre la media negativa tasa de eventos por celda; pre-TTX n = 1063 células, 4 deslizamientos; con TTX n = 2028 células, 4 deslizamientos; Fig. 6c). 1 μM de TTX disminuyó la tasa media de eventos en un factor menor de ~ 2×, de 1,04 × 10−4 a 4,99 × 10−5 eventos/célula/s (p = 0,019, prueba de significancia con arranque unilateral sobre la media de eventos negativos tasa por celda; pre-TTX n = 519 células, 2 deslizamientos; con TTX n = 722 células, 2 deslizamientos; Fig. 6d). El efecto de TTX sobre la frecuencia de eventos se recuperó después del lavado (TTX 10 μM; pre-TTX n = 486 células, 3 deslizamientos; con TTX n = 1066 células, 3 deslizamientos; lavado n = 1005 células, 3 deslizamientos; Fig. 6e). Para el análisis basado en características, la proyección de células MDA-MB-231 tratadas con TTX activo en el espacio del componente principal (PC) de las células activas no tratadas no reveló una diferenciación de clase DES con TTX (Fig. S3).

ai, ii Ejemplo de cursos de tiempo Vm de las 8 células más activas en adquisiciones antes (ai) y con (aii) 10 μM TTX. bi, bii Histogramas 2D a escala logarítmica de eventos detectados antes (bi) y con (bii) TTX de 10 μM. TTX erradica prácticamente todos los eventos hiperpolarizantes grandes (-VE, contorno naranja discontinuo). c Histogramas a escala logarítmica de la tasa de eventos −VE por celda para la aplicación previa y posterior de TTX 10 μM. La reducción en la media de 9,5 × 10−5 eventos/célula/s a 1,97 × 10−5 eventos/célula/s (~4× disminución) es significativa con p < 10−6. d El efecto de la TTX depende de la dosis: 1 μM de TTX redujo la tasa media de eventos en un factor menor de ~2×, de 1,04 × 10−4 eventos/célula/s a 4,99 × 10−5 eventos/célula/s (p = 0,019). e El efecto de TTX es reversible. Los efectos de la TTX pueden revertirse eliminando la toxina, lo que aumenta significativamente la tasa −VE.

Evaluamos si los canales de potasio activados por calcio (KCa) desempeñan un papel en la transducción de las fluctuaciones de calcio en las fluctuaciones de Vm medidas ópticamente. Tratamos los cultivos con iberiotoxina (IbTx) 100 nM, un bloqueador del canal KCa (BK) de gran conductancia, o apamina 100 nM, un bloqueador del canal KCa (SK) de pequeña conductancia. Tanto la IbTx como la apamina redujeron la frecuencia de −VE en aproximadamente 5 veces (Fig. 7). La IbTx 100 nM disminuyó la tasa media de VE de 11,1 × 10−5 a 1,94 × 10−5 eventos/célula/s (p < 10−6, prueba de significación con arranque unilateral sobre la tasa media de eventos negativos por celda; pre n = 2761 células, 6 láminas; con IbTx n = 1599 células, 6 láminas). La apamina 100 nM disminuyó la tasa media de VE de 10,9 × 10 −5 a 1,89 × 10 −5 eventos/célula/s (p < 10 −6, prueba de significación con arranque unilateral sobre la tasa media de −VE por celda; pre n = 3110, 6 lapsus; con apamin n = 2223, 5 lapsus). Sesiones de imágenes separadas de células MDA-MB-231 en las que se eliminaron IbTx y apamina después de 45 a 60 minutos de aplicación mostraron tasas de -VE comparables a los registros previos a IbTx y apamina. Después del lavado de IbTx 100 nM, la tasa media de VE fue de 18,6 × 10-5 eventos/célula/s (p = 0,997, prueba de significación de arranque bilateral sobre la tasa media de VE en comparación con los ensayos previos a apamina, lavado n = 817 celdas, 1 hoja). Después del lavado de apamina 100 nM, la tasa media de VE fue de 15,8 × 10-5 eventos/célula/s (p = 0,934, prueba de significación de arranque bilateral sobre la tasa media de VE en comparación con los ensayos previos a apamina; lavado n = 1379 celdas, 1 hoja). Por tanto, los efectos de los bloqueadores de los canales de KCa fueron reversibles.

ai, aii Ejemplo de cursos de tiempo Vm de las 8 células más activas en una adquisición antes (ai) y con (aii) IbTx 100 nM. b, c Histogramas 2D a escala logarítmica de la amplitud y duración de los eventos detectados antes (superior) y con (inferior) IbTx 100 nM (izquierda) y apamina 100 nM (derecha). d, e Histogramas a escala logarítmica de la tasa de eventos −VE por celda para la aplicación previa y posterior de IbTx 100 nM (izquierda) y apamina 100 nM (derecha).

Para evaluar el impacto del fenotipo canceroso y agresivo de MDA-MB-231 en la dinámica de Vm, lo comparamos con la dinámica de Vm de células MCF-10A no tumorigénicas (Fig. 8a, c). Al aplicar el mismo protocolo de imágenes, observamos que solo un pequeño subconjunto (0,46% ± 0,14%, n = 6944 células, 12 cubreobjetos) de células MCF-10A exhibió fluctuaciones de Vm en comparación con las células MDA-MB-231 (6,84% ± 0,97% , n = 3017 células, 13 cubreobjetos, Fig. 8e). Curiosamente, la incubación de las células con TGF-β1 (5 ng/mL), un factor de crecimiento conocido por estimular EMT34, aumentó el porcentaje de células que exhiben fluctuaciones de Vm a 0,81 ± 0,19 % (n = 3787 células, 13 cubreobjetos, Fig. 8b , d). Con TGF-β, la tasa media de VE aumentó de 2,85 × 10−6 a 1,4 × 10−5 eventos/célula/s (p = 0,000567, diferencia de medias de arranque unilateral a nivel de célula, Fig. 8c-e ).

a, b Imágenes y series temporales de Vm celular extraídas de células MCF-10A (a) y MCF-10A tratadas con TGF-β (b). c, d Histogramas de amplitud-duración a escala logarítmica 2D de los eventos c MCF-10A y d MCF-10A+TGF-β. Tanto MCF-10A como MCF-10A+TGF-β exhiben tasas de eventos significativamente más bajas que las células MDA-MB-231. e Comparación a nivel de celda de la tasa de eventos negativos. La incubación de células con TGF-β aumenta significativamente la tasa de eventos. f La incubación de MCF-10A en TGF-β altera el DES a nivel celular. Las células tratadas y no tratadas se ubican en diferentes áreas del espacio de PC 2D, lo que indica una diferenciación DES entre estos grupos. La línea discontinua negra es el mejor separador lineal calculado en los grupos tratados con TGF-β (naranja) y no tratados (azul). g A diferencia del MCF-10A no tratado que exhibió fluctuaciones de Vm de amplitudes variables, el tratamiento con TGF-β sesgó las fluctuaciones activas de Vm del MCF-10A de modo que se localizaron cerca de la clase MDA-MB-231 de gran amplitud "ondulante" en el espacio de PC combinado.

La visualización de las características normalizadas de las células MCF-10A en el espacio de PC 2D muestra la separación de DES entre las células MCF-10A tratadas con TGF-β y no tratadas (Fig. 8f). En particular, 7/27 células MCF-10A no tratadas y 9/33 células MCF-10A tratadas con TGF-β quedaron fuera del límite de decisión del mejor separador lineal (Fig. 8f, línea discontinua). En un espacio de características que combina DES MDA-MB-231 y DES MCF-10A, los DES MCF-10A se co-localizaron en un rango de clases de DES MDA-MB-231 en un espacio de PC 2D, mientras que el tratamiento con TGF-β aumentó la localización con grandes -amplitud Vm "ondeando" células MDA-MB-231 en el espacio de PC combinado (Fig. 8g). En resumen, el tratamiento con TGF-β aumentó la similitud de la dinámica de MCF-10A Vm con el MDA-MB de gran amplitud "ondeando". -231 clase DES, por lo que la diferenciación mesenquimatosa se correlaciona con mayores fluctuaciones de Vm.

Observamos correlaciones temporales entre eventos que ocurren en células MDA-MB-231 con imágenes simultáneas. La comparación por pares de series de tiempo de Vm celular reveló una mezcla de eventos sincrónicos y asincrónicos (Fig. 9a), lo que indica que estas correlaciones temporales no fueron causadas por diafonía óptica. Para evaluar si las correlaciones temporales del evento Vm ocurrieron a tasas significativamente superiores al azar, generamos rásteres de eventos para los transitorios de Vm detectados en intervalos de tiempo que van de 1 a 100 s (Fig. 9b, que muestra intervalos de 10 s). Luego calculamos el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) por pares para todas las celdas en cada FOV. Comparamos el PCC medio de las celdas con el PCC de rásteres mezclados aleatoriamente, que preservaron las estadísticas de eventos celulares pero destruyeron cualquier correlación temporal entre celdas. El PCC aumentó en general con el tamaño de los contenedores como se esperaba, y el PCC para los rásteres de eventos reales fue significativamente mayor que el PCC de los rásteres codificados para todos los tamaños de contenedores (Fig. 9c). Este resultado indica una correlación temporal significativa entre células de los eventos MDA-MB-231 Vm, por encima de la que se observaría por casualidad para tales eventos distribuidos aleatoriamente en el tiempo.

a Ejemplo de cursos de tiempo celulares temporalmente correlacionados desde un FOV. Las células separadas espacialmente (0,1,2) y (3,4,5) muestran hiperpolarizaciones sincronizadas. Es importante destacar que estas sincronizaciones ocurren en diferentes subconjuntos de los grupos y en celdas separadas espacialmente, lo que indica que la sincronización no se debe simplemente a la interferencia en las imágenes. b Cuantificación de la correlación. Los eventos se colocan en intervalos de tiempo, generando rásteres de eventos celulares. Se calculó la correlación promedio por pares entre celdas en una grabación. Se generó una hipótesis nula de correlación cero con las mismas estadísticas temporales mezclando temporalmente el ráster de eventos de cada celda para obtener una estimación del nivel esperado de correlación si no hubiera sincronización celular. c Las correlaciones por pares observadas son significativamente mayores en los datos observados que los datos mezclados para todos los tamaños de contenedores, lo que indica que la actividad celular está correlacionada temporalmente. Los puntos trazan la media y las barras indican el intervalo de confianza del 95% para el caso medido y barajado para cada tamaño de contenedor.

En un caso, observamos una ola de despolarizaciones transitorias que se propagaban a través de un subconjunto de células unidireccionalmente a través del FOV (Fig. 10). La pendiente de la línea ajustada a la distancia en función del tiempo máximo de hiperpolarización desde la primera celda activa muestra una velocidad de propagación de 27 μm/s (Fig. 10b, Película complementaria 2).

a Muestra las ROI celulares y sus series temporales ΔR/R0 de color correspondiente (derecha). b Traza la distancia desde la primera celda en función del tiempo en máxima hiperpolarización. La línea que se ajusta a esta relación muestra una velocidad de propagación de 27 μm/s. c Traza la amplitud transitoria máxima (%ΔR/R0) en función de la distancia desde la celda que muestra primero la hiperpolarización transitoria.

Los datos de imágenes de alta resolución celular indican que Vm fluctúa dinámicamente en subpoblaciones de líneas celulares de cáncer de mama altamente agresivas. Tanto el análisis basado en eventos como el basado en características indicaron que los eventos más estereotipados en las células MDA-MB-231 fueron "parpadeos" y "ondas" hiperpolarizantes transitorios. Estos eventos presentaron una correlación temporal intercelular significativa. La aplicación del bloqueador de VGSC TTX y dos inhibidores de KCa, IbTx y apamina, disminuyó sustancialmente la actividad dinámica de Vm en las células MDA-MB-231. La Vm de las células epiteliales mamarias MCF-10A no cancerosas fue estática en comparación con la de las células MDA-MB-231. El tratamiento de las células MCF-10A con TGF-β aumentó las fluctuaciones de Vm y aumentó la similitud basada en características de sus fluctuaciones temporales con las de las células MDA-MB-231.

La pinza de parche de células enteras es el estándar de oro para la medición absoluta de Vm. Esta técnica midió que la Vm en reposo en estado estacionario de las células de cáncer de mama humano está fuertemente despolarizada en relación con los epitelios normales15,18,19,20. Sin embargo, se había informado relativamente poco sobre la dinámica espontánea de Vm en células mamarias humanas. En principio, la pinza amperimétrica de celda completa podría detectar fluctuaciones de Vm, pero esto no se ha informado hasta la fecha. Es posible que la diálisis del espacio intracelular mediante la pipeta de parche lave o humedezca la maquinaria molecular subyacente a las fluctuaciones de Vm. Además, el bajo rendimiento de la grabación con parche podría dificultar la detección de DES heterogéneos exhibidos por sólo aproximadamente 1 de cada 20 células.

Nuestra detección de fluctuaciones de Vm en subconjuntos de cáncer de mama y células MCF-10A fue posible mediante la aplicación y adaptación de imágenes de tinte de voltaje electrocrómico. Fundamentalmente, nuestro enfoque permitió el seguimiento de las fluctuaciones espontáneas de Vm en cientos de células simultáneamente con una resolución unicelular. Los tintes electrocrómicos rastrean la Vm con una fidelidad temporal inferior a microsegundos35, pero también son fototóxicos, lo que limita la duración de la exposición, la velocidad y el tiempo total de obtención de imágenes (exposiciones de 3 ms a 5 Hz durante 920 s en nuestro caso). En el futuro, la utilización de sondas basadas en otros mecanismos, como la transferencia de electrones fotoinducida36 o la transfección con indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI) basados ​​en proteínas fluorescentes, puede aumentar el tiempo y/o la velocidad total de obtención de imágenes. Sin embargo, en el caso de los GEVI, el presupuesto de fotones suele estar limitado por el fotoblanqueo, un problema abordado por sensores quimiogenéticos38. Nuestro esquema de excitación ratiométrica redujo los artefactos de imagen debido al fotoblanqueo y las variaciones en la concentración y el volumen. Es importante tener en cuenta que la intensidad del tinte de voltaje informa cambios relativos en Vm, no en Vm absoluto. Una segunda limitación de nuestro análisis es que para eliminar los efectos del blanqueamiento y el movimiento celular, filtramos temporalmente nuestros rastros de Vm antes del análisis mediante la división por el promedio móvil de 1000 puntos del transcurso del tiempo. Este filtro impidió la detección de actividad que variara en escalas de tiempo inferiores a aproximadamente 0,01 Hz.

Una observación sorprendente es que, si bien todas las líneas de cáncer de mama exhibieron fluctuaciones de Vm en condiciones normales, MDA-MB-453, MDA-MB-468 y BT-474 fueron significativamente más activas a juzgar por la frecuencia de la tasa de eventos negativos (Fig. 2). BT-474 y MDA-MB-453 se han caracterizado previamente como subtipos luminales, mientras que MDA-MB-468 son basales A39. Se cree que las células progenitoras luminales de la glándula mamaria son las células de origen de los subtipos de cáncer luminal40. Es tentador especular que el aumento de las fluctuaciones de Vm puede ser una propiedad inherente de estos progenitores y/o sus derivados transformados. Los progenitores luminales también pueden dar lugar a cánceres basales y, de hecho, muchas líneas Basal-A en particular son muy similares a las líneas luminales en el sentido de que muestran características epiteliales y tienen perfiles mutacionales o de expresión similares a las líneas luminales BRCA139,41,42,43. Por lo tanto, la alta frecuencia de las fluctuaciones de Vm en MDA-MB-468 puede desmentir que también se originaron a partir de un progenitor luminal; a diferencia de otras líneas basales (es decir, MDA-MB-231) que examinamos. De hecho, estudios previos han observado similitudes morfológicas entre MDA-MB-468 y MDA-MB-453 en el sentido de que crecen como colonias "parecidas a uvas" en matrices 2D y 3D que reflejan una unión epitelial débil44. De hecho, un estado de unión débil, donde las células existen en un estado intermedio entre las formas epitelial y mesenquimatosa o en un estado 'híbrido E/M'45, puede correlacionarse con, o incluso ser propicio, un aumento de la actividad de Vm. De hecho, observamos la inducción de EMT por TGF-β de MCF-normal. 10A condujeron a un aumento en las fluctuaciones de Vm (Fig. 8). Curiosamente, anteriormente se demostró que el tratamiento con TGF-β también aumenta la expresión de VGSC en células MCF-10A 17. Potencialmente, las células en este estado híbrido retienen estructuras como las uniones en hendidura 46, lo que podría facilitar el intercambio iónico al tiempo que regula negativamente la adhesión célula-célula (es decir, implicando cadherinas).

En células MDA-MB-231, se describió recientemente un fenotipo Vi sensible a TTX mediante el registro extracelular de matriz de electrodos múltiples (MEA)28. En este estudio, cada electrodo de área grande (2 mm2) agregó señales de 100 s de células, lo que permitió la detección de eventos de picos raros en poblaciones agrupadas. Si bien nuestra frecuencia de imágenes de 5 Hz no pudo capturar la actividad de "pico rápido" (que dura 10 s de milisegundos) descrita por este estudio, es posible que los pulsos "de forma cuadrada" (que duran hasta 7 s) que detectaron los autores surjan de la misma dinámica de Vm reportada como parpadeante/ondeando en nuestra serie de imágenes de Vm. Nuestra metodología de imágenes complementa las grabaciones MEA de alta resolución temporal al permitir la localización de alta resolución celular de las fluctuaciones de Vm, necesaria para detectar patrones espaciotemporales, por ejemplo, la propagación de ondas Vm intercelulares (Fig. 10). El alto rendimiento de las imágenes de Vm que se demuestra aquí abre una nueva ventana a la fisiopatología "electroexcitable" del cáncer.

Aproximadamente el 7% de las células MDA-MB-231 demostraron fluctuaciones transitorias en Vm. Los eventos de gran amplitud eran "parpadeos" y "ondas" hiperpolarizantes. Esta observación aparece en marcado contraste con los tejidos clásicamente excitables como el cerebro, el corazón y los músculos que tienen una Vm en reposo cercana al potencial de inversión del K+ y que se despolarizan a través de la conductancia Na+ y/o Ca2+ cuando se excitan14. Las células MDA-MB-231 en reposo exhiben una Vm relativamente despolarizada, debido al menos en parte a una 'corriente de ventana' de Na+ conducida por Nav1.519,25,47. Los grandes eventos negativos implican que la conductancia del K+ (posiblemente Cl-) aumenta transitoriamente, o que la conductancia del Na+ disminuye transitoriamente, hiperpolarizando Vm hacia el potencial de Nernst de K+.

TTX redujo significativamente la frecuencia transitoria hiperpolarizante (-VE) en células MDA-MB-231. En presencia de TTX, el bloqueo de las corrientes persistentes de Na+ hiperpolariza la Vm en reposo en las células MDA-MB-23147. La hiperpolarización de Vm en reposo disminuiría la fuerza impulsora de la conductancia de la corriente hiperpolarizante transitoria, lo que podría explicar, al menos parcialmente, la reducción de las hiperpolarizaciones transitorias que detectamos en presencia de TTX. Será necesario seguir trabajando, por ejemplo, con agentes farmacológicos y silenciamiento génico, con parche-clamp simultáneo, para dilucidar completamente los canales y las corrientes que median las hiperpolarizaciones transitorias observadas aquí. La hiperpolarización del potencial de membrana en reposo inducida por TTX47 también puede disminuir la conductancia de los canales de BK activados por voltaje y Ca2+. De hecho, la reducción de las hiperpolarizaciones transitorias observadas con apamina e IbTx implica que los eventos de hiperpolarización espontánea pueden acoplarse a fluctuaciones de Ca2+48 a través de canales de K+ activados por Ca2+. Los estudios futuros pueden dilucidar aún más la interacción entre Ca2+ y Vm a través de imágenes simultáneas de calcio y voltaje, y mediante manipulación farmacológica o genética de la conductancia de KCa durante las imágenes de Vm y el parche-clamp.

Una distinción importante entre nuestro estudio de imágenes de Vm y registros previos de parche-clamp es que informamos cambios relativos en Vm en lugar de Vm absoluto. De hecho, los cambios sutiles de unos pocos milivoltios en la Vm en reposo detectados previamente mediante parche (por ejemplo, ref. 47) son invisibles para nuestra metodología de imágenes, no solo debido a la sensibilidad limitada sino también a la falta de capacidad para calibrar la Vm en una escala de voltaje absoluta. basado en la intensidad de la fluorescencia, incluso relaciones de intensidad. Por lo tanto, el patch-clamp anterior y nuestros rápidos estudios de imágenes de Vm de alto rendimiento generan datos complementarios que requerirán más trabajo para conectarse. Por ejemplo, se podría esperar que la fuerza impulsora de las hiperpolarizaciones transitorias mediadas por K+ sea mayor para las células individuales con la Vm en reposo más despolarizada. Para probar esta predicción es necesario medir la Vm absoluta. Además de la pinza de parche, la medición absoluta de Vm se puede realizar ópticamente a través de imágenes de fluorescencia de vida útil de Vm (VF-FLIM)49,50. Sin embargo, las implementaciones actuales de VF-FLIM tienen una resolución temporal <0,5 Hz y, por lo tanto, no pueden rastrear las rápidas fluctuaciones que se caracterizan aquí.

La heterogeneidad de las fluctuaciones de Vm coincide con la expresión heterogénea de VGSC en células MDA-MB-23115. Las mayores fluctuaciones de amplitud fueron "parpadeos" y "ondas" hiperpolarizantes transitorios. Estas hiperpolarizaciones podrían modular directamente la amplitud de la corriente de "ventana" conducida por Nav1.519,25, cambiando la concentración de Na+ intracelular y las vías de señalización moduladas por Na+ aguas abajo, por ejemplo, SIK17. Una función principal de la actividad de VGSC en estas células es controlar la proteólisis mediante La acidificación pericelular es impulsada por el intercambio sodio-hidrógeno (NHE1) 51, 52. El hecho de que la actividad VGSC hiperpolarizante impulsada por Vm ocurriera de manera intermitente en las células sugeriría lo siguiente: primero, podría garantizar un mejor control de la proteólisis, es decir, la invasión En segundo lugar, evitaría la entrada excesiva de Na+ en las células y un posible desequilibrio osmótico que podría comprometer la viabilidad celular 53. Se requiere más trabajo para evaluar los posibles mecanismos y consecuencias de las fluctuaciones de Vm.

Nuestros resultados respaldan la idea de que Vm y su comportamiento dinámico están relacionados con el comportamiento de las células cancerosas. En primer lugar, las fluctuaciones de Vm fueron mucho más comunes en las líneas celulares cancerosas en comparación con las células epiteliales de mama MCF-10A "normales". En segundo lugar, el bloqueo de la actividad de los canales VGSC y KCa amortiguó las fluctuaciones de Vm en las células MDA-MB-231. En tercer lugar, por el contrario, se sabe que la actividad dinámica de Vm en células MCF-10A aumentada después del tratamiento con TGF-β induce un comportamiento agresivo en estas células54. Aunque el papel de la Vm en reposo en el inicio, la proliferación, la invasión y la metástasis del cáncer se ha caracterizado en detalle (revisado por la referencia 2), las implicaciones funcionales de las fluctuaciones rápidas y dinámicas de la Vm aún no se han dilucidado. En el futuro, las imágenes de Vm se podrán aprovechar para determinar, célula por célula, las relaciones correlativas y causales entre el comportamiento de Vm y los fenotipos metastásicos y estructurales.

Cultivamos células MDA-MB-231, un amable obsequio del laboratorio de la Dra. Janine Erler, en DMEM con alto contenido de glucosa (GIBCO, n.° 41966029) suplementado con FBS al 5 % (Sigma, n.° F7524) y penicilina-estreptomicina (Sigma, n.° P4333). Para obtener imágenes, colocamos células de 10k a 30k en cubreobjetos de vidrio recubiertos con colágeno de 12 mm (colágeno de cola de rata, Sigma, # 122-20). Las células se sembraron en placas la tarde anterior a la obtención de imágenes. Las imágenes se realizaron en medio Leibovitz L-15 sin rojo fenol (Thermo Fisher, n.º 21083027), excepto durante los experimentos de control con alto contenido de K+, donde en su lugar se utilizó solución salina fisiológica de mamíferos (MPS) (descrito a continuación).

Las células MCF-10A se obtuvieron de ATCC. Se cultivaron en DMEM/F12 (GIBCO, #31331) suplementado con suero de caballo al 5 % (GIBCO, #16050), 10 µg/ml de insulina (Sigma, #I-1882), 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (Sigma, #E-9644), 100 ng/ml de toxina del cólera (Sigma, #C-8052), 500 ng/ml de hidrocortisona (Sigma, #H-0888) y 100 mg/ml de penicilina/estreptomicina (GIBCO, #15070). Se confirmó que las células eran negativas para micoplasma (kit de detección por PCR e-Myco plus Mycoplasma, iNtRON Biotechnology). El pase se realizó utilizando tripsina-EDTA al 0,25% (GIBCO) seguido de centrifugación (1000 rpm, 4 min) y resuspensión en medio completo. Algunos conjuntos de células MCF-10A se cultivaron en factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β; Peprotech, #100-21) a 5 ng/ml en medio completo durante 48 a 169 h para impulsar la EMT.

Las siguientes líneas celulares se cultivaron como parte del panel de líneas celulares de cáncer de mama humano investigado. MDA-MB-468 (un amable obsequio del laboratorio del Dr. George Poulogiannis, ICR), Cal-51 (un amable obsequio del laboratorio del Prof. Nicholas Turner, ICR), SUM-159, Hs578t (un amable obsequio del laboratorio de la Dra. Rachel Natrajan, ICR) y MDA-MB-453 (un amable obsequio del laboratorio de la profesora Claire Isacke, ICR) se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa (GIBCO, #41966-029), suplementado con un 10% de calor. -FBS inactivado (GIBCO, #10500-064) y penicilina-estreptomicina al 1% (GIBCO, #15140-122). T-47D y BT-474, amables obsequios del laboratorio del Prof. Nicholas Turner (ICR), se cultivaron en RPMI 1640 (GIBCO, n.° 11835-063), suplementados con 10 % de FBS y 1 % de penicilina-estreptomicina. Antes de la obtención de imágenes, se recubrieron cubreobjetos de vidrio de 12 mm con 50 µg/ml de colágeno tipo I de cola de rata (Corning, n.º 354236, lote 0295002) en ácido acético 0,02 M. Se incubaron cubreobjetos recubiertos con colágeno durante 2 h a 37 °C. Los cubreobjetos se lavaron dos veces con PBS y se dejaron secar a temperatura ambiente. Todas las líneas celulares se pasaron con tripsina-EDTA al 0,25% (GIBCO), se centrifugaron (1000 rpm, 5 min) y se resuspendieron en un medio completo. Para obtener imágenes, se sembraron diluciones de células de 10k a 30k en cubreobjetos preparados. Se permitió que las células se incubaran durante la noche antes de obtener imágenes para una unión óptima. Se confirmó que todas las líneas celulares eran negativas para micoplasma (kit de detección por PCR de micoplasma e-Myco Plus, iNtRON Biotechnology).

Preparamos una solución madre de 200 μM del colorante de voltaje electrocrómico di-4-AN (F) EP (F) PTEA29 (alícuotas de 100 nmol, sondas potenciométricas) en solución L-15. La solución madre se mantuvo durante un máximo de 3 días después de disolverse. Inmediatamente antes de la obtención de imágenes, lavamos suavemente las células adheridas al cubreobjetos tres veces con L-15 calentado antes de colocarlas bajo el microscopio. El cubreobjetos se pesó en su lugar con un anillo de tantalio y se sumergió en el tinte diluido en L-15 hasta una concentración final de 3 µM. Las células descansaron en esta configuración durante 15 minutos antes de obtener la imagen. Durante la obtención de imágenes, las células se mantuvieron a una temperatura entre 30 y 37 °C mediante un sistema de perfusión de agua de circuito abierto casero o mediante una plataforma de cámara calentada de circuito cerrado (TC-324C, PM-1, Warner Instruments).

Nuestro microscopio de epifluorescencia de campo amplio hecho a medida formó una imagen de las células a través de un objetivo vertical de inmersión en agua ×25 1.0 NA (XLPLN25XSVMP, Olympus) y una lente de tubo de longitud focal de 180 mm (TTL180-A) en un semiconductor científico complementario de óxido de metal ( sCMOS) (Orca Flash 4 v2, Hamamatsu). Las imágenes se realizaron con excitación secuencial de dos colores y se obtuvieron imágenes en un solo canal espectral. La fluorescencia se excitó proporcionalmente en dos canales, lo que dio como resultado señales de voltaje de dirección opuesta en la emisión recopilada (Fig. 1c). Los LED se accionaron mediante un Cairn OptoLed (P1110/002/000). El primer canal se iluminó con LED de 405 nm (Cairn P1105/405/LED), se filtró con un paso de banda de 405/10 nm (Semrock LD01-405/10) y se combinó con un dicroico de paso largo de 495 nm (Semrock FF495-DI03). y un paso adicional de 496 nm de largo (Semrock FF01-496/LP). El segundo canal se iluminó con un LED de 530 nm (Cairn P1105/530/LED), se filtró con un filtro de 520/35 nm (Semrock FF01-520/35) y se combinó con un dicroico de paso largo de 562 nm (Semrock FF562-DI03). ). La emisión se recopiló a través de un filtro de paso de banda de 650/150 nm (Semrock FF01-650/150) en la cámara sCMOS (Fig. 1a). Las imágenes se adquirieron en Micromanager 255 con el modo de 'escaneo lento' de Orca Flash 4, usando el obturador global y el reinicio del cuadro con agrupación digital 4 × 4. Las imágenes se realizaron a 5 Hz. Durante cada período de imagen, se adquirió en rápida sucesión un cuadro de exposición de 3 ms iluminado con cada LED (Fig. S4). Las intensidades de iluminación para cada canal se igualaron aproximadamente entre cada canal y se ajustaron para dar una intensidad de señal de alrededor de 4000 cuentas/píxel en membranas celulares marcadas. Las intensidades estaban típicamente entre 0,1 y 1,3 mW/mm2 para la excitación azul y 1,5 y 3,4 mW/mm2 para la excitación verde.

Adquirimos cada prueba, que consta de secuencias de 10.000 cuadros (5000 adquisiciones excitadas por color dual) en diferentes ubicaciones del cubreobjetos. Las ubicaciones de las imágenes se seleccionaron de áreas confluentes (mediana 975 células/mm2, rango intercuartil 605, 1247 células/mm2). Adquirimos entre 1 y 6 ensayos por cubreobjetos, y cada ensayo se realizó en una ubicación distinta. En los experimentos con tetrodotoxina (TTX), primero tomamos imágenes de 1 o 2 ensayos de control sin TTX (ensayos 'pre'). Luego agregamos 1 mM de citrato TTX (Abcam, ab120055) en solución madre de PBS al medio de imágenes para lograr una concentración final de 1 o 10 μM. Se tomaron imágenes de 1 a 4 ensayos en presencia de TTX (ensayos "posteriores"). Para ciertos experimentos de TTX de 10 μM, después de 1 a 2 ensayos adquiridos en presencia de TTX, reemplazamos el medio que contiene TTX con medio L-15 que contiene tinte regular y tomamos imágenes de 1 a 2 ensayos en esta condición ("lavado").

En los experimentos de IbTx y apamina, primero tomamos imágenes de 3 ensayos de control sin estos agentes (ensayos 'pre-'. Luego agregamos 24,1 μM de citrato de IbTx (Tocris, #1086) o citrato de apamina (Tocris, #1652) en L-15. al medio de imágenes para lograr la concentración final de 100 nM. En experimentos separados, tratamos las células con apamina 100 nM o IbTx durante 45 a 60 minutos. Luego, las células se lavaron tres veces con L-15 y se agregó colorante de voltaje como se describe arriba para evaluar la dinámica de Vm después del lavado de los inhibidores de KCa.

Se realizaron pruebas de lavado con alto contenido de potasio en solución salina fisiológica de mamíferos (MPS48), que consistió en (en mM): 144 NaCl, 5,4 KCl, 5,6 d-glucosa, 5 HEPES, 1 MgCl2, 2,5 CaCl2. A mitad de la prueba, se lavó una solución con alto contenido de potasio para despolarizar las células y validar la función del tinte de voltaje. Esta solución estaba osmóticamente equilibrada y constaba de (en mM): 49,4 NaCl, 100 KCl, 5,6 d-glucosa, 5 HEPES, 1 MgCl2, 2,5 CaCl2.

Evaluamos el rango de cambio de fluorescencia esperado para cambios conocidos en Vm mediante abrazadera de voltaje de celda completa e imágenes de voltaje simultáneas. Se tomaron imágenes de las células en medio Liebovitz L-15 sin rojo fenol a temperatura ambiente. Se seleccionaron células sanas marcadas con tinte y se parchearon con pipetas de entre 3 y 10 MΩ. La pipeta contenía Ag/AgCl bañada en solución intracelular (en mM): 130 K-Gluconato, 7 KCl, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, 10 Fosfocreatina-Na, 10 HEPES. Las señales de abrazadera de voltaje se amplificaron con un Multiclamp 700B (Molecular Devices) y se digitalizaron con Power 1401 (Cambridge Electronic Design) usando Spike2 versión 9.

Las imágenes radiométricas se realizaron como se describió anteriormente pero a una velocidad aumentada de 100 fotogramas/s. Durante cada prueba de imágenes, la Vm se limitó durante períodos de 1 segundo a valores que variaban entre −60 y +30 mV en incrementos de 10 mV. Se extrajeron cursos de tiempo fluorescentes de una región celular de interés (ROI) alrededor de la célula parcheada para ambos canales de excitación. Las pruebas se corrigieron con lejía y se convirtieron a ΔF/F0 utilizando un ajuste lineal a su evolución temporal. Calculamos la relación promedio de fotogramas excitados de azul a verde (ΔR/R0) en todas las pruebas en cada potencial de retención. Se ajustó una línea a ΔR/R0 vs. Vm. El gradiente de línea refleja la sensibilidad de ΔR/R0 a Vm (% de cambio por 100 mV) para cada celda (n = 12 celdas).

Todo el análisis de datos se realizó en Python 3 utilizando NumPy56, SciPy57, Tifffile, Scikit-image58, Scikit-learn59 y Pandas60. Las figuras se generaron usando MatPlotLib61. Nuestro esquema de excitación de doble color generó series temporales de imágenes entrelazando fotogramas excitados por luz azul y verde (Fig. 3a). Restamos el valor oscuro constante de cada cuadro y separamos la serie temporal en dos canales de color. Aplicamos un filtro de paso alto por píxeles, rechazando señales inferiores a 0,01 Hz, a las series de tiempo separadas. En particular, las señales que varían lentamente (principalmente blanqueamiento) se eliminaron de cada canal dividiendo las pilas en píxeles por una versión filtrada temporalmente de sí mismas. El filtro era un filtro uniforme de 1000 puntos de longitud. El filtro era simétrico (es decir, el punto de tiempo t0 se vio afectado por los puntos t > t0 y t < t0 por igual). Luego, estas series de tiempo normalizadas por filtro se dividieron, cuadros azules por cuadros verdes, para encontrar la relación de imagen para cada punto de tiempo (Fig. 3a). Las células se segmentaron utilizando CellPose62, utilizando el modelo de segmentación citoplasmática predeterminado y un diámetro celular aproximado de 30 píxeles. Se agregaron a mano segmentaciones adicionales de células activas que la red Cellpose no identificó. Los ROI segmentados se erosionaron con un solo (1 ronda de binario) antes de extraer los cursos de tiempo del ROI para suprimir los efectos del movimiento en los bordes de la celda. Para cada ROI erosionado, calculamos la mediana de los valores de píxeles en cada momento. La media de los cursos de tiempo se restó y compensó para que fueran simétricos en aproximadamente 1.

Implementamos un algoritmo de detección de eventos para identificar cambios significativos en ΔR/R0 que reflejan la fluctuación de Vm. Primero calculamos el curso temporal de la desviación estándar de píxeles intra-ROI para cada ROI erosionado. Filtramos los cursos de tiempo de la mediana (calculada como arriba) y la desviación estándar con un filtro gaussiano σ = 3 puntos (es decir, 0,6 s). Los eventos de fluctuación de Vm se identificaron cuando el valor medio de píxel filtrado temporalmente divergió de 1, su valor promedio de tiempo, en más de 2,5 veces la desviación estándar filtrada temporalmente (Fig. 1h). Los eventos cortos se eliminaron y los eventos vecinos se fusionaron mediante 2 iteraciones de apertura binaria y luego 2 rondas de cierre binario en la matriz de eventos detectada. Cuando los eventos consistieron en ΔR/R0 positivos y negativos, se dividieron en eventos completamente positivos y completamente negativos.

Las células se consideraron moribundas/muertas y se excluyeron del análisis cuando los valores de píxeles sin procesar aumentaron en brillo en más de un 25% durante la adquisición en el canal azul, lo que indica una pérdida de polarización de la membrana. Los eventos que surgen de cambios de brillo no relacionados con el voltaje se identificaron como eventos simultáneos y se excluyeron del análisis. En la serie de imágenes MCF-10A, donde los eventos fueron muy raros, se identificaron artefactos de imagen y se excluyeron más de tres eventos superpuestos en más del 30 % en el tiempo. En los datos de MDA-MB-231, se excluyeron los eventos en los que más de cinco eventos se superpusieron en más del 50 % en el tiempo. Después de la detección de eventos, todas las series temporales de células activas se evaluaron mediante inspección visual de videos procesados ​​para rechazar eventos causados ​​por polvo flotante, cambios focales u otros artefactos de imagen aparentes. Los eventos que cumplieron con las medidas de control de calidad tanto automatizadas como manuales se analizaron en cuanto a frecuencia, polaridad, amplitud y duración.

En el análisis basado en características, solo incluimos ensayos que completaron el período completo de imágenes de 920 s (18 279 de 18 752) y luego aplicaron el algoritmo de detección de eventos descrito anteriormente para identificar células "activas" (982 de 18 279). Se excluyeron las series de todos los tiempos que contenían artefactos de imagen aparentes (polvo, etc.). Después del control de calidad y la detección de eventos, se admitieron en el estudio 297 series temporales MDA-MB-231, 28 MCF-10A y 33 MCF-10A+TGF-β canal de análisis basado en características que se describe a continuación (Fig. 4a, b).

Como complemento al análisis basado en eventos, se desarrolló Cellular DES Pipeline para clasificar las series temporales extraídas del ROI según sus características dinámicas más destacadas extraídas por el algoritmo Catch-2232. El análisis realizado con Cellular DES Pipeline proporciona información sobre las características de las series temporales más allá de la simple detección y cuantificación de eventos, lo que permite clasificar la dinámica heterogénea de Vm en grupos similares.

De las series de tiempo admitidas, extrajimos 22 características de la serie de tiempo mediana del ROI de cada celular con el algoritmo Catch-22 (Fig. 4c). Después de trazar la distribución de las características individuales, alrededor del 80% (259/324) de las celdas compartieron el mismo valor para la característica correspondiente al primer mínimo de la función de información automática, que posteriormente excluimos de la lista de características. Cambiamos la escala de los valores de las características sin procesar para las 21 características restantes entre 0,0001 y 1 y aplicamos la transformación Box-Cox para normalizar sus distribuciones. Luego cambiamos la escala de los valores normalizados entre 0 y 1 para garantizar una ponderación igual en los algoritmos de agrupación. Para evaluar la cantidad de clases de firma eléctrica dinámica (DES), implementamos agrupamiento jerárquico y modelado de mezcla gaussiana (GMM) en las 21 características normalizadas. Ambos algoritmos de agrupamiento generaron grupos con coeficientes de silueta, que miden la diferencia de subtipo63, disminuyendo a sus niveles más bajos entre 5 y 6 grupos (Fig. 4d). Con base en estas puntuaciones de silueta y en la inspección visual de las series temporales, elegimos clasificar las series temporales en cuatro tipos, ya que esto resultó en las clases más homogéneas. Basándonos en el patrón general de cada tipo, nombramos las clases DES: parpadeo pequeño (parpadeo-s), ondulación, ruidoso y parpadeo grande (parpadeo-l).

Para seleccionar una serie de tiempo ejemplar de cada clase DES (Fig. 5), realizamos un análisis de componentes principales (PCA) y visualizamos las cuatro clases en un espacio de características bidimensional. Cada grupo de funciones ocupa un área única del espacio de la PC. Para identificar las series de tiempo ejemplares de cada tipo, calculamos los componentes de cada característica y dibujamos un vector para los coeficientes de PC1 y PC2 de cada característica (Fig. 5). Estos vectores, por lo tanto, apuntan al tipo que exhibe las características correspondientes de manera más destacada. Para identificar series de tiempo ejemplares de cada tipo, ordenamos las series de tiempo según la característica cuyo vector apunta a ese tipo.

Las tasas medias de eventos negativos (-VE) se compararon mediante una prueba de significación automática, unilateral o bilateral, con el número de células, el número de cultivos ("slips") y los valores p resultantes especificados en cada caso. Los Datos complementarios contienen los datos utilizados para generar todas las cifras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos electrofisiológicos y de imágenes generados y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

El código de análisis está disponible en https://github.com/peq10/cancer_vsd64.

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Los autores desean agradecer a la Dra. Julia Gallinaro por sus consejos sobre la cuantificación de la sincronía dentro de los cursos de tiempo. Este trabajo fue apoyado por un premio Pump-prime de la Red Integrada de Imágenes Biológicas (IBIN3AF), la Real Academia de Ingeniería en el marco del programa de becas de investigación RAEng (RF1415/14/26), el Consejo de Investigación en Biotecnología y Biología (BB/R009007/ 1), un premio Wellcome Trust Seed (subvención n.º 201964/Z/16/Z), el Consejo de Investigación en Ingeniería y Ciencias Físicas (subvención n.º EP/L016737/1 al Imperial College) y por Cancer Research UK y Stand Premio de la Fundación del Programa Up to Cancer UK a CB (C37275/1A20146).

Estos autores contribuyeron igualmente: Peter Quicke, Yilin Sun.

Departamento de Bioingeniería, Imperial College London, Londres, SW7 2AL, Reino Unido

Peter Quicke, Yilin Sun y Amanda J. Foust

Instituto Francis Crick, Londres, NW1 1AT, Reino Unido

Peter Quicke

Instituto de Investigación del Cáncer, Biología del Cáncer, Londres, SW3 6JB, Reino Unido

Mar Arias-García, Melina Beykou y Chris Bakal

Departamento de Ingeniería Eléctrica y Electrónica, Imperial College London, Londres, SW7 2AZ, Reino Unido

Melina Beykou

Facultad de Medicina de la Universidad de Connecticut, Centro RD de Berlín para Análisis y Modelado Celular, Farmington, CT, EE. UU.

Corey D. Acker

Departamento de Ciencias de la Vida, Imperial College London, Londres, SW7 2AZ, Reino Unido

Mustafa BA Djamgoz

Centro de Investigación en Biotecnología, Universidad Internacional de Chipre, Haspolat, Nicosia, TRNC, Mersin 10, Turquía

Mustafa BA Djamgoz

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PQ ideó el sistema y los métodos de adquisición de imágenes con la guía de CDA y AJF, PQ, YS, MBAD, CB y AJF diseñaron los experimentos. PQ e YS realizaron los experimentos y analizaron las imágenes. PQ diseñó y PQ e YS realizaron el análisis basado en eventos. MAG y MB cultivaron y sembraron las células MCF-10A, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-474, CAL-51, Hs-578T, SUM159 y T-47D. YS desarrolló Cellular DES Pipeline con la guía de CB, MBAD, AJF y PQYS realizó el análisis basado en características con la ayuda de PQPQ, YS, MAG, MB, CB, MBAD y AJF escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Chris Bakal o Amanda J. Foust.

Los autores declaran los siguientes intereses en competencia: CDA es propietario y empleado de Potentiometric Probes LLC, que desarrolla y vende tintes sensibles al voltaje. MBAD participa en una pequeña empresa de biotecnología que desarrolla moduladores de canales iónicos como fármacos contra el cáncer. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Communications Biology agradece a Han-Gang Yu y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Chao Zhou y Karli Montague-Cardoso. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Quicke, P., Sun, Y., Arias-García, M. et al. Las imágenes de voltaje revelan las firmas eléctricas dinámicas de las células de cáncer de mama humano. Común Biol 5, 1178 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04077-2

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Recibido: 11 de noviembre de 2021

Aceptado: 05 de octubre de 2022

Publicado: 11 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04077-2

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